Identification and molecular characterization of ethylene-insensitive mutants in Cucurbita pepo

Abstract

El genoma de Cucurbita pepo comprende 263 Mb y 34,240 genes organizados en 20 cromosomas diferentes. Para mejorar nuestra comprensión de la función génica, hemos generado una plataforma de mutantes EMS que consta de 3.751 familias M2 independientes. La calidad de la colección se ha evaluado en base a los resultados de fenotipado y re-secuenciación del genoma completo (WGS). La evaluación fenotípica de toda la plataforma en la etapa de plántula ha demostrado que la tasa de variación para rasgos fácilmente observables es de más del 10%. El porcentaje de familias con plántulas albinas o cloróticas excedió el 3%, similar o mayor a lo encontrado en otras colecciones EMS de cultivos de Cucurbitáceas. Tras evaluar 4 plantas adultas de 300 familias independientes, se encontró que más del 28% de las familias tenían un efecto fenotípico observable sobre diferentes rasgos vegetativos y reproductivos, incluyendo: el vigor de las plantas; el tamaño y la forma de las hojas; la expresión sexual y la determinación del sexo; y la producción y desarrollo de frutos. Dos muestras de ADN genómico, derivadas de 20 plantas de dos familias mutantes, se sometieron a WGS utilizando la metodología NGS con el fin de estimar la densidad, el espectro, la distribución y el impacto de las mutaciones inducidas por EMS. El número de mutaciones EMS en los genomas de las familias L1 y L2 fue de 1.704 y 859, respectivamente, lo que representa una densidad de 11,8 y 6 mutaciones por Mb, respectivamente. Como se esperaba, las mutaciones predominantes inducidas por EMS fueron las transiciones C>T y G>A (80,3% en L1 y 61% en L2), que se encontraron distribuidas al azar a lo largo de los 20 cromosomas de C. pepo. Las mutaciones afectaron principalmente a las regiones intergénicas, pero el 7,9 y el 6% de las mutaciones EMS identificadas en L1 y L2, respectivamente, se ubicaron en el exoma, y el 0,4 y el 0,2% podían tener un impacto moderado o alto en la función génica. Estos resultados han proporcionado información sobre el uso potencial de la plataforma mutante en el descubrimiento de nuevos alelos tanto para la genómica funcional como para la mejora genética de las especies del género Cucurbita. El etileno es el regulador clave de la determinación del sexo en las especies monoicas de la familia Cucurbitaceae. Esta hormona regula la transición floral femenina y la conversión de cada meristemo floral en una flor femenina o masculina, lo que se logra deteniendo el crecimiento del estambre o el carpelo en las primeras etapas del desarrollo de la flor. Muchos de los genes reguladores descubiertos hasta la fecha codifican para enzimas de biosíntesis de etileno, pero se sabe poco sobre la importancia de los componentes de señalización de etileno en el control de este proceso de desarrollo. Un cribado de la plataforma de mutantes EMS para triple respuesta a etileno en plántulas etioladas permitió identificar cuatro mutantes insensibles a etileno dominantes o semidominantes: ein1 (etr1b), ein2 (etr1a), ein3 (etr2b) y EIN4 (etr1a-1). Las cuatro mutaciones alteraron los mecanismos de determinación del sexo. Las mutaciones etr1a y etr2b promovieron la conversión de flores femeninas en flores bisexuales y hermafroditas, y monoecia en andromonoecia, retrasando también la transición floral femenina y reduciendo el número de flores pistiladas por planta. Las mutaciones etr1a-1 y etr1b, por otro lado, fueron capaces de bloquear por completo la transición floral femenina de C. pepo, haciendo que las plantas produjeran flores masculinas indefinidamente (androecia). Ya sea en homocigosis o heterocigosis, las cuatro mutaciones etr alteraron la tasa de crecimiento y la maduración de los pétalos y los carpelos de flores pistiladas, alargando el tiempo requerido para que las flores alcanzaran la antesis, y favoreciendo el desarrollo partenocárpico del fruto. El análisis BSA mediante secuenciación de genoma completo (BSA-Seq) reveló que los genes subyacentes a las cuatro mutaciones etr codifican para receptores de etileno. Se descubrió que etr1a, etr1a-1 y etr1b eran mutaciones de cambio de sentido en el dominio transmembrana de unión a etileno de los receptores CpETR1A y CpETR1B, mientras que etr2b era una mutación de cambio de sentido entre los dominios GAF e histidina quinasa del receptor de etileno CpETR2B. El nivel de insensibilidad al etileno en los mutantes simples y dobles homocigóticos y heterocigotos para las cuatro mutaciones etr estaba determinado por la fuerza de cada alelo mutante, pero también por el número de alelos WT y etr en la planta, lo que indica que los tres genes receptores de etileno no tienen una función totalmente redundante, sino que cooperan en el control de la respuesta de etileno. El nivel de insensibilidad a etileno determinará el fenotipo sexual de la planta, que va desde monoecia en plantas WT sensibles a etileno, pasando por andromonoecia en las plantas parcialmente insensibles a etileno, hasta androecia en las plantas más insensibles a etileno. Se observó que el bloqueo del programa de desarrollo femenino en los mutantes etr1b y etr1a-1 estaba asociado con una falta de activación transcripcional de CpACS11, CpACO2 y CpACS2/7, tres genes de biosíntesis de etileno necesarios para activar el desarrollo floral femenino, pero no cambiaba la expresión de CpWIP1, un factor de transcripción que parece ser necesario para el desarrollo de flores masculinas en otras especies de Cucurbitáceas. Se propone un modelo que integra la biosíntesis de etileno y los genes receptores de etileno en la red genética que regula la determinación del sexo en C. pepo.

SUMMARY: The Cucurbita pepo genome comprises 263 Mb and 34,240 gene models organized in 20 different chromosomes. We generated an EMS mutant platform consisting of 3,751 independent M2 families so as to improve our understanding of gene function. The quality of the collection has been evaluated based on phenotyping and whole-genome resequencing (WGS) results. The phenotypic evaluation of the whole platform at the seedling stage has demonstrated that the variation rate for easily-observable traits is more than 10%. The families with albino or chlorotic seedlings exceeded 3% of the platform, similar or higher to that found in other EMS collections of cucurbit crops. When four adult plants from each of 300 independent families were evaluated, more than 28% of apparent mutations were found to be associated with vegetative and reproductive traits, including: plant vigor; leaf size and shape; sex expression and sex determination; and fruit set and development. Two pools of genomic DNA, derived from 20 plants taken from each of two mutant families, were subjected to WGS by using NGS methodology so as to estimate the density, spectrum, distribution and impact of EMS-induced mutation. The number of EMS mutations in the genome of the L1 family was 1,704 and in the L2 one 859, which represents a density of 11.8 and 6 mutations per Mb, respectively. As expected, the predominant EMS-induced mutations were C>T and G>A transitions (80.3% in L1, and 61% L2), that were found to be randomly distributed along the 20 chromosomes of C. pepo. The mutations mostly affected intergenic regions, but 7.9% of the identified EMS mutations in L1 and 6% of those in L2, were located in the exome. 0.4% (L1) and 0.2% (L2) of the identified mutations had a moderate or high putative impact on gene functions. These results provide information regarding the potential usefulness of the obtained mutant platform in the search for novel alleles. This concerns both functional genomics and Cucurbita breeding, by using direct- or reverse-genetic approaches. Ethylene is the key regulator of sex determination in the monoecious species of the family Cucurbitaceae, this hormone determines which individual floral meristem will develop into a female or a male flower. This is achieved by the arrest of stamen or carpel growth in early stages of flower development, and also during the transition between male and female developmental phases. Many of the regulatory genes discovered to date code for ethylene biosynthesis enzymes, but little is known of the importance of ethylene signaling components in the control of this developmental process. A high-throughput screening of the EMS platform for triple ethylene response in etiolated seedlings allowed the identification of four semi-dominant or dominant ethylene-insensitive mutants: ein1 (etr1b), ein2 (etr1a), ein3 (etr2b) and EIN4 (etr1a-1). These four mutations modified sex determination mechanisms. The mutations etr1a and etr2b promoted the conversion of female into bisexual or hermaphrodite ones, and monoecy into andromonoecy. They also delayed the transition to female flowering and reduced the number of pistillate flowers per plant. The mutations etr1a-1 and etr1b, on the other hand, were able to block female flowering transition of C. pepo; this induces plants to produce male flowers indefinitely (androecy). Whether in homozygous or heterozygous conditions, the four etr mutations disrupted the growth rate and maturation of petals and carpels of pistillate flowers, thereby lengthening the time required for flowers to reach anthesis and encouraging the growth rate of ovaries and the parthenocarpic development of fruits. Bulked-segregant analysis coupled to whole-genome sequencing (BSA-Seq) revealed that the genes affected by the four etr mutations encode for ethylene receptor proteins. The etr1a, etr1a-1 and etr1b were found to be missense mutations that resulted in an amino acid substitution in the ethylene-binding transmembrane domain of the ethylene receptors CpETR1A and CpETR1B, while etr2b was a missense mutation that affected to the coiled-coil domain between the GAF and histidine-kinase of the receptor CpETR2B. The level of ethylene insensitivity in homozygous and heterozygous single and double mutants was determined both by the strength of each mutant allele but also by the number of WT and etr alleles in the plant, indicating that the three ethylene receptor genes do not have a redundant function but cooperate in the control of ethylene response. The level of ethylene response in the plant determines its final sex phenotype: monoecy in ethylene-sensitive WT plants; andromonoecy in the partial ethylene-insensitive ones, and androecy in those which are the most highly ethylene insensitive. The blocking of female flowering transition by etr1a-1 and etr1b -the two mutants which have the strongest effect- was found to be associated with a lack of transcriptional activation of the three ethylene biosynthesis genes CpACS11, CpACO2 and CpACS2/7, which are required for female flower development. However, there was no change in the expression of CpWIP1, a transcription factor gene that seems to be required for male flower development in other cucurbit species. A model is proposed here, integrating the ethylene biosynthesis and receptor genes into the genetic network that regulates sex determination in C. pepo.