La mutagénesis como herramienta de genómica funcional en tomate: caracterización de los mutantes succulent stamens2 y hairplus

Abstract

Abstract Over the past decades, huge advance has been made in the genetic study of crop species in order to overcome the numerous challenges faced by agriculture nowadays. Some of these challenges include modifications of traditional agricultural methods posed by climate change, as well as the increase in world population. With this aim, the development of new commercial varieties capable of coping with a changing environment has revealed as the most effective strategy. However, natural variability among cultivated species is low and as a result, genetic improvement rises as the main approach to develop more productive as well as resistant varieties. Tomato (Solanum lycopersicum L.) is one of the major horticultural crops worldwide, whose demand continues to increase due to its nutritional properties as well as numerous forms of consumption. Tomato is also an excellent model species to understand the development of fleshy fruit plants, since it holds numerous favourable traits such as a high productivity rate, a relatively short life cycle and a high tolerance to abiotic stresses. All these features led in 2012 to the completion of tomato genome sequencing by an international consortium, which has allowed to make an enormous progress in understanding the genomic organization of this species. However, from the total number of identified genes, only 70% approximately have an assigned gene function, based on sequence homologies and in silico predictions. Hence, current efforts are focused on the identification of new gene functions by means of functional genomics strategies. One of the most widely used reverse genetics strategies for the identification of new genes and their functional characterisation is the study of mutants, since they represent a valuable genetic resource as well as an enormous source of variability. Mutagenesis has been extensively used in tomato and other horticultural crops, being chemical mutagenesis one of the most commonly used strategies. Chemical mutagenic agents pose great advantages, since they are easy to handle and relatively harmless. Among them, alkylating substances such as ethyl methanesulfonate (EMS) have been widely employed, since they have proved to be highly effective in inducing plant mutations. Given the enormous usefulness of EMS, we have used this mutagenic agent in order to obtain a mutant collection in the tomato Moneymaker cultivar. A total number of 8988 EMS mutant plants have been characterised, among which we have identified relevant phenotypic alterations related to leaf morphology, size and growth habit, as well as alterations of the morphology and colour of flowers and fruits. The use of this mutagenesis strategy combined with next generation sequencing techniques has allowed us to characterise new gene functions of great interest to deeply understand the vegetative and reproductive development of tomato. Among the identified mutants is succulent stamens2 (sus2), which exhibits an aberrant stamen morphology. As a result, mutant plants are unable to produce pollen and mutant fruits are parthenocarpic (seedless) and smaller. Furthermore, stamens remain attached to fruits during development and ripening as fleshy structures, whose morphology resembles that of carpels. The analysis of mutant plants stamen morphology was carried out by scanning electron microscopy, which showed that stamens undergo a complete homeotic change into carpels, as well as alterations produced in petals epidermal cells morphology. Mapping strategies allowed us to identify that sus2 mutation is located in an exon of the TOMATO MADS BOX 6 (TM6) transcription factor, a B class gene involved in the development of the second and third floral whorls. As a result of TM6 loss of function, the expression levels of other MADS box genes involved in flower development are altered in sus2 mutant plants, revealing a crucial role for TM6 in the maintenance of B class function as well as in the correct balance of other proteins involved in floral morphogenesis. On the other hand, a mutant which we have called hairplus (hap) since it shows a higher trichome density was also identified. This phenotype is particularly obvious in inflorescence stems as well as in vegetative stems of mutant plants, and it is of great interest given that a positive correlation between the increase in trichomes density and pest resistance has been widely described. Furthermore, the hap mutation specifically increases type I glandular trichomes density, as deduced from the analysis performed in wild type and mutant plants tissues. Genetic mapping allowed us to identify the hap mutation in a Histone N-Lysine Methyl Transferase, a group of proteins related with the epigenetic control of gene expression by means of histone methylation. Therefore, the regulation of trichome density can be considered as a new function of these proteins. On the other hand, the analysis of trichome density in loss of function lines (RNAi and CRISPR) as well as in gain of function lines (35S) confirmed that the identified mutation is the responsible for the hap mutant phenotype. Finally, as a result of the mutation, large number of modifications are accounted for the transcriptome and the epigenome of mutant plants, including the differential expression of 92 genes, as well as 2.113 differentially methylated cytosines. Taken together, all these results prove that HAP is a key regulator of tomato trichome density by means of epigenetic regulation of gene expression. Resumen A lo largo de las pasadas décadas se han realizado numerosos avances en el estudio genético de especies hortícolas principalmente para tratar dar respuesta a los retos que enfrenta la agricultura en la actualidad. Entre estos desafíos destacan la presión que ejerce el cambio climático sobre los modelos de cultivo establecidos, así como el incremento de la población mundial. Con este fin, el desarrollo de nuevas variedades comerciales capaces de hacer frente a un entorno cambiante se revela como la alternativa más eficaz. Sin embargo, la variabilidad natural en especies cultivadas parece no ser suficiente para superar todos esos retos. Es por ello que la ONU, además de declara la década 2011-2020 “Década de la ONU sobre Diversidad" ha encargado a la FAO que se implique en impulsar programas de creación de diversidad mediante distintas estrategias de mutagénesis. Solo así podremos continuar desarrollando variedades más productivas a la par que resistentes a estrés bióticos y abióticos. Entre los cultivos hortícolas de mayor relevancia a nivel mundial destaca el tomate (Solanum lycopersicum L.), cuya demanda aumenta continuamente debido a sus propiedades nutricionales y a sus numerosas formas de consumo. Esta especie es además un excelente modelo génico para comprender el desarrollo de plantas de fruto carnoso, ya que presenta enormes ventajas como una elevada tasa de productividad, un ciclo de vida relativamente corto y caracteres agronómicos muy favorables como una elevada tolerancia a estreses abióticos. Todo ello propició que en 2012 un consorcio internacional completara la secuenciación de su genoma, lo que ha permitido realizar enormes progresos en la comprensión de la organización genómica de esta especie. Sin embargo, del total de genes identificados, sólo el 70% aproximadamente tiene una función génica asignada, basada en homologías de secuencias y predicciones in silico. De ahí que los esfuerzos actuales se centren en completar la asignación de nuevas funciones génicas mediante estrategias de genómica funcional. Una de las estrategias de genómica reversa más ampliamente utilizada para la identificación de nuevos genes y su caracterización funcional es el estudio de mutantes, que constituyen un valioso recurso genético y una enorme fuente de variabilidad. La mutagénesis ha sido ampliamente utilizada en tomate y otras hortícolas y el uso de agentes mutagénicos químicos en particular, constituye una de las estrategias más comúnmente utilizada. Entre las principales ventajas de estas sustancias destaca que son fáciles de manipular y relativamente inocuas. Entre estos agentes se encuentran las sustancias alquilantes como el etil metil sulfonato (EMS), que ha demostrado ser altamente efectivo en la inducción de mutaciones en plantas. Habida cuenta de la enorme utilidad del EMS, en el presente trabajo se ha obtenido y caracterizado una colección de mutantes empleando este agente mutagénico en el cultivar Moneymaker de tomate. Se han caracterizado alrededor de 8988 plantas mutantes pertenecientes a esta colección, entre las que se han observado alteraciones fenotípicas relevantes de la morfología de la hoja, el tamaño y hábito de crecimiento de la planta, así como alteraciones de la morfología y color de flores y frutos. La combinación de esta estrategia de mutagénesis con técnicas de secuenciación masiva nos ha permitido caracterizar nuevas funciones génicas de enorme interés para comprender en profundidad el desarrollo vegetativo y reproductivo de tomate. Entre los mutantes identificados como parte de esta colección se encuentra el mutante succulent stamens2 (sus2), que se caracteriza por una morfología floral alteradas, en lo referente a los pétalos y en especial los estambres que están mal formado. Como consecuencia, las plantas mutantes no producen polen y sus frutos son partenocárpicos (sin semillas) y de menor tamaño. Además, durante el desarrollo y la maduración del fruto los estambres se convierten en carpelos carnosos que permanecen adheridos al fruto de las plantas mutantes. El análisis de la morfología de los estambres de plantas mutantes mediante microscopía electrónica de barrido reveló que estos experimentan una conversión homeótica completa en carpelos, así como alteraciones homeóticas parciales en la morfología de las células epidérmicas de los pétalos. La identificación de la localización cromosómica de la mutación sus2 se realizó mediante mapeo genético utilizando marcadores codominantes en combinación con una estrategia de mapeo por secuenciación. Ello nos permitió identificar dicha mutación en un exón del factor de transcripción TOMATO MADS-BOX 6 (TM6), un gen de clase B implicado en el control de la identidad de los órganos florales del segundo y tercer verticilo. Como resultado de la pérdida de función de TM6, la expresión de otros genes MADS box implicados en el desarrollo floral está alterada en el mutante sus2, lo que demuestra que TM6 es crucial para el mantenimiento de la función de clase B, así como para el correcto funcionamiento de otras proteínas implicadas en la morfogénesis floral, función previamente hipotetizada por algunos autores, pero puesta en tela de juicio por otros. Por otra parte, durante la caracterización de la colección se identificó también un mutante al que hemos denominado hairplus (hap), ya que muestra una elevada densidad de tricomas. Este fenotipo es particularmente evidente en los tallos vegetativo y de las inflorescencias, y resulta de enorme interés ya que se ha demostrado que existe una correlación positiva entre el incremento de la densidad de tricomas y la resistencia a plagas de herbívoros. Además, la mutación hap incrementa específicamente la densidad de los tricomas glandulares de tipo I, como se deduce del análisis realizado en plantas de fenotipo silvestre y plantas mutantes. La localización cromosómica de la mutación se realizó mediante una estrategia combinada de cartografía genética y mapeo por secuenciación. De esta forma, se localizó la mutación en una Histona N-Lisina Metil Transferasa, una proteína relacionada con el control epigenético de la expresión génica mediante la metilación de histonas. De este modo, la regulación de la densidad de tricomas constituye una nueva función génica identificada para este grupo de proteínas. Por otra parte, el análisis de la densidad de tricomas en líneas de pérdida (RNAi y CRISPR) y de ganancia de función (35S) confirmaron que la mutación identificada es la responsable del fenotipo mutante hap. Finalmente, como resultado de la mutación se producen numerosas modificaciones del transcriptoma y del epigenoma de plantas mutantes, que incluyen la expresión diferencial de 92 genes, así como 2113 citosinas diferencialmente metiladas. Todo ello demuestra que HAP es un regulador clave de la densidad de tricomas de tomate mediada por la regulación epigenética de la expresión génica, lo cual supone la primera demostración de este tipo de control en un carácter del mayor interés agronómico.