Estrategias para el estudio de plaguicidas específicos y sus metabolitos mediante espectrometría de masas de alta resolución

Abstract

La presente Tesis Doctoral aporta nueva información relacionada con el comportamiento de plaguicidas específicos en alimentos y medioambiente, así como el estudio de la presencia de los metabolitos derivados de ellos. Para ello se han empleado técnicas de extracción genéricas como el método QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged y Safe), la extracción sólido-líquido (Solid-Liquid Extraction, SLE) y la extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction, SPE). Posteriormente se ha llevado a cabo el análisis mediante dos técnicas cromatográfícas ampliamente utilizadas como son la cromatografía de gases (Gas Chromatography, GC) y la cromatografía de líquidos (Liquid Chromatography, LC) acopladas a analizadores de espectrometría de masas de alta resolución (High Resolution Mass Spectrometry, HRMS). Se han usado dos modos de trabajo, dirigido y no dirigido, aplicándose en este último, las variantes de análisis de sospechosos (suspect screening) y análisis de desconocidos (unknown analysis). La Tesis se ha estructurado en cuatro partes. Mientras que la primera de ellas se basa en la revisión de los avances de la espectrometría de masas en el ámbito alimentario y medioambiental, las tres restantes están relacionadas con el estudio de plaguicidas específicos y sus metabolitos. De esta forma, la primera parte se centra en una revisión bibliográfica de las técnicas analíticas empleadas en la presente Tesis doctoral, así como sus modos de análisis y/o trabajo. Los trabajos incluidos son los siguientes: • Revisión bibliográfica de los avances en cromatografía de líquidos de ultra alta resolución (Ultra High Performance Liquid Chromatography, UHPLC) acoplada a MS (UHPLC-MS) en la última década para el análisis de una gran variedad de compuestos orgánicos (plaguicidas, micotoxinas, fármacos y compuestos fenólicos) en medioambiente y alimentos. Esta revisión incluye la descripción de las ventajas y desventajas del uso de la espectrometría de masas de baja resolución (Low Resolution Mass Spectrometry, LRMS) frente a la de HRMS. • Revisión bibliográfica de las aplicaciones más importantes en el campo de análisis de contaminantes en alimentos mediante el uso de herramientas metabolómicas aplicadas a datos de LC-MS y GCMS. En la misma se discuten los modos de trabajo que la HRMS permite como son el análisis dirigido y no dirigido, incluyendo suspect screening y unknown analysis. La segunda parte se centra en el estudio de dos insecticidas, desarrollados en la última década y de amplio interés como son flonicamida y tiociclam, así como sus metabolitos. La técnica de análisis empleada fue la UHPLC-HRMS. Los estudios desarrollados en esta parte incluyen: • Desarrollo y validación de un procedimiento analítico basado en el método QuEChERS para la extracción de flonicamida y sus metabolitos en pimiento mediante UHPLC-HRMS. • Estudio del comportamiento en campo y laboratorio del insecticida flonicamida en naranja mediante UHPLC-HRMS. La técnica de extracción empleada fue el método QuEChERS seguida de una etapa de purificación mediante extracción dispersiva en fase sólida (dispersive Solid-Phase Extration, d-SPE) con amina primaria secundaria (Primary Secondary Amine, PSA). Además se monitorizaron sus metabolitos conocidos, ácido 4-trifluorometilnicotínico (TFNA), 4-(trifluorometil)nicotinoil glicina (TFNG) y 4-trifluorometilnicotinamida (TFNA AM). También se llevaron a cabo estudios de rutas metabólicas empleando la técnica de resonancia magnética nuclear (Nuclear Magnetic Resonance, NMR). • Estudio del comportamiento en laboratorio del pro-insecticida tiociclam en tomate mediante UHPLC-HRMS, monitorizando su metabolito más conocido, nereistoxina. Se identificaron de manera tentativa otros cuatro metabolitos mediante análisis no dirigido. La técnica de extracción empleada fue el método QuEChERS en su versión tamponada AOAC 2007. La tercera parte se centra en el estudio del comportamiento de cuatro herbicidas y sus metabolitos en matrices medioambientales usando la UHPLC-HRMS como técnica de análisis. Los herbicidas estudiados fueron quizalofop-p-etil, quizalofop-p-tefuril, propaquizafop y dimetacloro. A tal fin se desarrollaron los siguientes trabajos de investigación: • Estudio del comportamiento en laboratorio de los herbicidas quizalofop-p-etil, quizalofop-p tefuril y propaquizafop en suelos y aguas mediante UHPLC-HRMS. Además se llevó a cabo la separación quiral de su metabolito más conocido, (RS)-quizalofop-p, usando para ello una fase estacionaria quiral que permitió la separación de los enantiómeros. • Estudio del comportamiento en laboratorio del herbicida dimetacloro en suelos y aguas mediante UHPLC-HRMS. Se llevó a cabo un estudio de sus metabolitos desconocidos mediante análisis no dirigido. La técnica de extracción empleada fue el método QuEChERS, incluyendo una etapa de d-SPE con C18 para suelo, mientras que en agua se empleó únicamente SPE. Durante la etapa de SPE fue necesario adicionar a la muestra un modificador de par iónico, tetrabutilamonio, para mejorar la retención de los analitos, en especial los metabolitos, los cuales tenían una mayor polaridad. La cuarta parte está centrada en la determinación de varios fungicidas como famoxadona, propamocarb y fenamidona, en alimentos y matrices ambientales. Se desarrollaron los siguientes artículos científicos: • Estudio del comportamiento en invernadero del fungicida famoxadona en calabacín, pepino y tomate mediante UHPLC-HRMS. Paralelamente se llevó a cabo un estudio de sus metabolitos desconocidos mediante análisis no dirigido, conduciendo a la identificación tentativa de un nuevo metabolito de famoxadona. • Estudio del comportamiento en laboratorio del fungicida famoxadona en suelos y aguas mediante UHPLC-HRMS. Para ello se llevó a cabo un análisis no dirigido de tipo suspect screening, usando como base de datos la creada a partir del anterior trabajo en calabacín, pepino y tomate, identificándose tres metabolitos de famoxadona. • Estudio del comportamiento en invernadero de los fungicidas propamocarb y fenamidona en calabacín, pepino y tomate mediante UHPLC-HRMS y GC-HRMS. Esta fue la primera vez que se empleó la GC-Q-Orbitrap para este tipo de estudios. También se realizó un estudio de sus metabolitos desconocidos, identificando tentativamente cuatro nuevos compuestos, no descritos hasta la fecha para propamocarb y uno en el caso de fenamidona. • Estudio del comportamiento en laboratorio de los fungicidas propamocarb y fenamidona en suelos y aguas mediante UHPLC-HRMS. Se llevó a cabo una búsqueda de metabolitos mediante suspect screening (metabolitos detectados en trabajos previos en matrices vegetales) y mediante unknown analysis detectando de forma tentativa tres nuevos metabolitos de propamocarb. Abstract: The current Thesis provides new knowledge related to the behaviour of selected pesticides in food and environment, as well as the monitoring of both known and unknown metabolites. For this purpose, generic extraction techniques as QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe), Solid-Liquid Extraction (SLE) and Solid Phase Extraction (SPE) were used. After that, determination was carried out using two chromatographic techniques widely applied, as gas chromatography (GC) and liquid chromatography (LC) coupled to high resolution mass spectrometry (HRMS) analysers. Two working modes, targeted and non-targeted, were employed using the last one to perform suspect screening and unknown analysis. The Thesis was divided in four sections. The first one was focused on the review of the recent trends of the application of MS in the field of food and environmental analysis, whereas the other sections were focused on the study of specific pesticides and their metabolites. Thus, the first part includes a review of the analytical techniques employed in the Thesis, as well as their applications and/or working modes. The included studies were: • Review of the development of ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) coupled to MS in the last decade for the analysis of a wide range of organic compounds (pesticides, mycotoxins, drugs and phenolic compounds) in food and environmental samples. This review included the advantages and disadvantages of low resolution mass spectrometry (LRMS) in comparison with HRMS. • A review discussing the most important applications developed in the field of contaminant analysis in food applying metabolomics tools, using LC-MS and GC-MS data. A discussion about the workflows that can be applied when HRMS is used, as targeted and non-targeted analysis including suspect screening and unknown analysis, was performed. The second part was based on the study of two insecticides, widely used in the last decade, as flonicamid and thiocyclam, as well as their metabolites. The analytical technique employed was UHPLC coupled to HRMS. The developed studies included in this section were: • Development and validation of an analytical procedure based on QuEChERS method for the extraction of flonicamid and its metabolites in bell pepper by UHPLC-HRMS. • Field and laboratory studies of flonicamid in orange using UHPLCHRMS. The extraction method used was the QuEChERS procedure followed by a clean-up step using dispersive solid-phase extraction (d-SPE) with primary secondary amine (PSA). Its known metabolites, 4-(trifluoromethyl)nicotinic acid (TFNA), 4-(trifluoromethyl) nicotinoyl glycine (TFNG) and 4-trifluoromethylnicotinamide (TFNA-AM), were also monitored. In addition, metabolomics studies were carried out using the Nuclear Magnetic Resonance technique (NMR). • Laboratory study of the behaviour of the proinsecticide thiocyclam in tomato by UHPLC-HRMS, monitoring its metabolite nereistoxin. Four new metabolites of nereistoxin were tentatively identified by non-targeted analysis. The selected extraction method was the buffered QuEChERS version, AOAC 2007. The third section includes the study of the behaviour of four herbicides and their metabolites in environmental matrices using UHPLC-HRMS. The studied herbicides were quizalofop-p-ethyl, quizalofop-p-tefuryl, propaquizafop and dimethachlor. The following research studies were carried out: • Laboratory study of the behaviour of the quizalofop-p-ethyl, quizalofop-p-tefuryl and propaquizafop herbicides in soils and water by UHPLC-HRMS. In addition, a chiral separation of (RS)- quizalofop-p was carried out using a chiral stationary phase that allowed the enantiomeric separation of both isomers. • Laboratory study of the behaviour of the dimethachlor herbicide in soils and water by UHPLC-HRMS. An unknown metabolite study was carried out by non-targeted approach. For the extraction of compounds from soils a QuEChERS based method was employed, including a d-SPE step with C18, meanwhile in water, SPE was used. During the SPE step, the addition of tetrabutylammonium was necessary to improve the retention of the analytes, specially the metabolites with a higher polarity. The fourth section was based on the determination of several fungicides as famoxadone, propamocarb and fenamidone in food and environmental matrices. The following studies were developed: • Greenhouse study of the behaviour of the famoxadone fungicide in courgette, cucumber and tomato by UHPLC-HRMS. Additionally, a study of the unknown metabolites was carried out by non-targeted analysis, performing a tentative identification of a new metabolite of famoxadone. • Laboratory study of the behaviour of the famoxadone fungicide in soils and water by UHPLC-HRMS. A suspect screening was performed using a home-made database, identifying three famoxadone metabolites. • Greenhouse study of the behaviour of the propamocarb and fenamidone fungicides in courgette, cucumber and tomato by UHPLC-HRMS and GC-HRMS. This was the first time that GCHRMS was employed for this type of studies. In addition, a study of unknown metabolites was done, and four new metabolites, not previously described for propamocarb, and one of fenamidone, were tentatively identified. • Laboratory study of the propamocarb and fenamidone fungicides in soils and water using UHPLC-HRMS. A suspect screening (metabolites detected in previous studies in vegetable matrices) and unknown analysis studies were carried out, and three new metabolites of propamocarb were tentatively detected.