In vitro antitumor activity of arachidonic and docosahexaenoic acids as both monoacylglycerols and free fatty acids on colorectal cancer cells

Abstract

Abstract Colorectal cancer (CRC) is one of the most common and mortal types of cancer. There is an increasing evidence that some polyunsaturated fatty acids (PUFA) are very effective as antitumor compounds on cancer cells through different mechanisms. PUFA occurs in the human body at different forms, from which monoacylglycerols (MAG) and free FA (FFA) promote important health benefits; for instance, they prevent the onset of CRC. This document is structured in three chapters: Chapter I is related to two articles corresponding to two different methodologies to obtain highly purified PUFA. In the first article, a process involving six edible oils, namely: olive, linseed, sunflower, evening primrose, DHASCO® and ARASCO® to obtain different monounsaturated FA (MUFA)- and PUFA- based MAG is described. The purification process starts with an enzymatic hydrolysis using porcine pancreatic lipase, then the reaction products were fractionated by using two liquid chromatography columns. The first chromatography column process with silica gel as stationary phase allowed to separate MAG form the rest of hydrolysis products. In the second step an open column chromatography containing silver nitrate coated silica gel as stationary phase allowed to purify the MAG-enriched fractions containing the different MUFA- and PUFA-based MAG from the corresponding oils. Overall, MAG based on oleic (OA, 18:1n-9), linoleic (LA, 18:2n-6), α-linolenic (ALA, 18:3n-3), γ-linolenic (GLA, 18:3n-6), arachidonic (ARA, 20:4n-6) and docosahexaenoic (DHA, 22:6n-3) acids were isolated at high yields and purities (92.6, 97.4, 95.3, 90.9, 100.0 and 95.3% purity, respectively). The second article describes the process to obtain highly concentrated eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5n-3), DHA and ARA using the urea complexation methodology. For this study, the urea:FA ratio was optimized. Five oil sources were used: commercially available tuna oil, DHASCO®, ARASCO®, and MARINOL®, and the oil from the microalga Nannochloropsis. Concentrates were obtained at 98.0, 43.0 and 82.8% of total FA for DHA, EPA, and ARA, respectively. In Chapter II, the in vitro antitumor activities of DHA- and ARA-based FFA molecules on HT-29 CRC cells are described. For stablishing activities, the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide test (MTT) along with lactate dehydrogenase (LDH) and caspase-3 assays were used. In addition, proteome changes were assessed by “sequential windowed acquisition of all theoretical mass spectra” quantitative proteomics (SWATH-MS), followed by pathway analysis, to determine the affected molecular mechanisms. In all assays, DHA inhibited cell proliferation of HT-29 CRC cells to a higher extent than ARA and acted primarily by downregulating proteasome particles, while ARA presented a dramatic effect on all six DNA replication helicase particles. In Chapter III, similar design and technology were used to investigate the actions of both DHA and ARA as MAG molecules, and a comparison of results with those obtained using the corresponding FFA was effected. Cell assays revealed that ARA- and DHA-MAG exercised dose-dependent antiproliferative actions, with DHA-MAG acting on cancer cells more efficiently than ARA-MAG. SWATH-MS, validated by parallel reaction monitoring and followed by pathway analysis, revealed that DHA-MAG had a massive effect in the proteasome complex, while the ARA-MAG main effect was related to DNA replication. Prostaglandin synthesis also resulted inhibited by DHA-MAG. Results clearly demonstrated the ability of both ARA- and DHA-based MAG to induce cell death in CRC cells, which suggests a direct relationship between chemical structure and antitumoral actions. In short, the present doctoral dissertation demonstrates the antitumor activity of ARA and DHA as both MAG and FFA against HT-29 CRC cells. This activity was stablished by MTT, LDH and Caspase-3 test, and by analyzing the changes observed in the cell proteome after ARA and DHA treatment. The results of this doctoral dissertation indicate that both DHA and ARA constitute potential chemopreventive agent candidates. Resumen El cáncer colorrectal (CRC) es uno de los tipos de cáncer más comunes y mortales. Cada vez hay más evidencias de que algunos ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) son muy eficaces como compuestos antitumorales en células de cáncer a través de diferentes mecanismos de acción. Los PUFA están presentes en el ser humano en diferentes formas, siendo los monoacilgliceroles (MAG) y los ácidos grasos libres (FFA) los que promueven importantes beneficios para la salud, por ejemplo, previenen la aparición del CRC. Por ello, la tesis está estructurada en tres capítulos: El capítulo I contiene dos artículos que engloban dos metodologías para obtener PUFA altamente purificados. En el primer artículo se describe un proceso que implica seis aceites comestibles (oliva, lino, girasol, onagra, DHASCO® y ARASCO®) para obtener diferentes FA monoinsaturados (MUFA) y PUFA en forma de MAG altamente purificados. El método de purificación consiste en una hidrólisis enzimática con lipasa pancreática porcina y un posterior fraccionamiento de los productos de hidrólisis mediante dos columnas de cromatografía líquida. La primera cromatografía con gel de sílice como fase estacionaria permitió separar la fracción de MAG del resto de los productos de hidrólisis. La segunda, que contenía gel de sílice recubierto de nitrato de plata como fase estacionaria, permitía purificar las fracciones enriquecidas de MAG para obtener MAG a base de MUFA y PUFA de los aceites correspondientes. En general, se aislaron el ácido oleico (OA, 18:1n9), linoleico (LA, 18:2n-6), α-linolénico (ALA, 18:3n-3), γ-linolénico (GLA, 18:3n-6), araquidónico (ARA, 20:4n-6) y docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3) con altos rendimientos y purezas (92,6, 97,4, 95,3, 90,9, 100,0 y 95,3% de pureza, respectivamente). En el segundo artículo se describe la obtención de los ácidos eicosapentaenoico (EPA, 20:5n-3), DHA y ARA altamente concentrados utilizando el método de la urea, en el cual se optimizó la relación urea:FA. Para preparar este artículo se utilizaron cinco fuentes de aceite: el aceite de atún disponible en el mercado, los aceites DHASCO®, ARASCO® y MARINOL®, y el aceite de la microalga Nannochloropsis. Finalmente, se obtuvieron concentrados de DHA, EPA y ARA con purezas de 98,0, 43,0 y 82,8% del total de FA. En el capítulo II se determinaron las actividades antitumorales in vitro de las moléculas de FFA basadas en DHA y ARA en las células HT-29 de CRC. Para estudiar las actividades antitumorales se utilizó el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT), junto con el ensayo de lactato deshidrogenasa (LDH) y la caspasa-3. Además, los cambios de los proteomas se evaluaron mediante proteómica cuantitativa (SWATH-MS), seguida de un análisis de las rutas o pathways, para determinar los mecanismos moleculares afectados. En todos los ensayos, DHA inhibió la proliferación celular de las células HT-29 en mayor medida que ARA y actuó principalmente reduciendo la regulación de las partículas de proteasoma, mientras que ARA presentó un efecto significativo en las seis partículas de la helicasa de replicación del ADN. En el capítulo III se utilizó un diseño y una tecnología similares al capítulo II para investigar las acciones del DHA y ARA como moléculas de MAG, y se efectuó una comparación de los resultados con los obtenidos utilizando los FFA. Los ensayos celulares revelaron que ARA- y DHA-MAG ejercían acciones antiproliferativas dependientes de la dosis y el tiempo, y que el DHA-MAG actuaba sobre las células cancerosas de forma más eficiente que el ARA-MAG. SWATH-MS, validado por la monitorización de reacciones paralelas y seguido por el análisis de pathways, reveló que DHA-MAG tenía un efecto masivo en el complejo proteasoma, mientras que el efecto principal de ARA-MAG estaba relacionado con la replicación del ADN. La síntesis de prostaglandinas también resultó inhibida por DHA-MAG. Los resultados demostraron claramente la capacidad del ARA y del DHA-MAG para inducir la muerte celular en las células de CRC, lo que sugiere una relación directa entre la estructura química y las acciones antitumorales. En resumen, la presente tesis doctoral demuestra la actividad antitumoral de ARA y DHA como MAG y FFA contra las células HT-29 del CRC. Esta actividad fue establecida por las pruebas MTT, LDH y Caspasa-3, y por el análisis de los cambios observados en el proteoma de la célula después del tratamiento de ARA y DHA. Los resultados de esta tesis doctoral indican que tanto DHA como ARA constituyen potenciales candidatos a agentes quimiopreventivos.