Inmovilización de una β-xilosidasa de Geobacillus stearothermophilus como CLEAs

Abstract

Se purificó una β-xilosidasa de la familia 52 de Geobacillus stearothermophilus (XynB2WT) y su mutante Y509E (XynB2Y509E) con actividad dual de β-xilosidasa y xilanasa con el fin de preparar agregados enzimáticos entrecruzados (CLEAs). Se utilizó sulfato de amonio (78%) como agente precipitante y glutaraldehído (25 mM) como agente de reticulación. La reacción de reticulación se llevó a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente y en agitación horizontal. En estas condiciones, los CLEAs producidos para XynB2WT y para XynB2Y509E presentaron un 46% y un 34% de actividad recuperada. La caracterización morfológica realizada a los CLEAs por Microscopía Electrónica de Barrido puso en evidencia una mezcla homogénea de agregados de pequeño tamaño. La caracterización bioquímica de enzimas libres e inmovilizadas demostró que el pH y la temperatura óptimos de reacción eran mayores en XynB2WT libre que en su forma inmovilizada (pH 6,5 frente a 5 y temperatura de 75 °C frente a 65 °C). Sin embargo, en XynB2Y509E libre e inmovilizada permanecieron constantes en términos generales (pH 6,5 para el CLEA y 6 para la libre y una temperatura de 55 °C para ambas). El análisis de los parámetros cinéticos muestra un valor de Km menor para el CLEA de ambas enzimas (2,44 mM para XynB2WT libre frente a 3,86 mM en XynB2WT-CLEA y 2,13 mM para XynB2Y509E libre frente a 3,53 mM para XynB2Y509E

-CLEA). La inmovilización mejoró la termoestabilidad en la enzima mutada, presentando una Tm ligeramente mayor en el CLEA de XynB2Y509E. Por último, se comprobó que ambas enzimas mantienen aproximadamente un 50% de actividad al cabo de los 10 ciclos de reacción realizados a pH 6,5 y 60 °C, lo cual sugiere una buena estabilidad operacional de los agregados producidos. A β-xylosidase from the family 52 of Geobacillus stearothermophilus (XynB2WT) and its mutant Y509E

(XynB2Y509E) with dual activity of β-xylosidase and xylanase were purified in order to prepare cross- linked enzyme aggregates (CLEAs). Ammonium sulfate (78%) was used as precipitating agent and

glutaraldehyde (25 mM) as crosslinking agent. The crosslinking reaction was carried out for 30 minutes at room temperature with horizontal stirring. Under these conditions, the CLEAs produced for XynB2WT and for XynB2Y509E showed 46% and 34% recovered activity. The morphological characterization of the CLEAs carried out by scanning electron microscopy revealed a homogeneous mixture of small-sized aggregates. Biochemical characterization of free and immobilized enzymes showed that the optimal reaction pH and temperature were higher in free XynB2WT than in its immobilized form (pH 6.5 vs. 5 and temperature 75 °C vs. 65 °C). However, free and immobilized XynB2Y509E remained broadly constant (pH 6.5 for CLEA and 6 for free and a temperature of 55 °C for both). The analysis of the kinetic parameters shows a lower Km value for the CLEA of both enzymes (2.44 mM for free XynB2WT versus 3.86 mM in XynB2WT-CLEA and 2.13 mM for free XynB2Y509E versus 3.53 mM for XynB2Y509E

-CLEA). The immobilization improved the thermostability in the mutated enzyme, presenting a slightly higher Tm in the CLEA of XynB2Y509E. Finally, it was found that both enzymes maintain approximately 50% activity after the 10 reaction cycles carried out at pH 6.5 and 60 °C, which suggests a good operational stability of the aggregates produced.